Biological Psychiatry: 童年的社會隔離對大鼠大腦功能連接性的影響

為探究精神疾病中早期社會壓力領域的一般風險因素，對斷奶后社會性隔離（post-weaning social isolation, PWSI）飼養(yǎng)的嚙齒類動物進行觀察，獲得對于例如精神分裂癥在內的神經發(fā)育疾病可解釋性，目前已經成為了一種廣泛使用的動物研究模型。但是在動物模型中，與其相關早期社會壓力引發(fā)的相關影像學特征研究還很匱乏。

在本文的實驗中，作者采集了斷奶隔離3周后的大鼠靜息態(tài)功能核磁數(shù)據(jù)，以研究精神障礙患者（主要是社會孤立代理的孤獨癥精神癥狀）的連接變化，通過基于種子點到全腦的連接分析，研究了前額與后部腦區(qū)的功能連接的變化。另外為研究區(qū)域網絡以及全局拓撲屬性的變化，作者使用基于圖論的分析方法進行研究（包括節(jié)點屬性和全局屬性）。結果發(fā)現(xiàn)，經歷斷奶后社會隔離（PWSI）的大鼠在以前額部分腦區(qū)作為種子點的功能出現(xiàn)減弱，而大腦后部則相反。基于圖論的分析揭示了相似的結果，同時這種改變與行為結果相關，在隔離分飼大鼠中還伴隨模塊性的降低。由上述分析，本文支持了前人研究中對于預設社會神經回路包含前額腦區(qū)的設想，這種神經回路的改變可能是社會壓力導致精神障礙風險的關鍵通路。通過說明這種以中心性以及非模塊性改變?yōu)橹饕卣?，由早年社會生活壓力而引發(fā)的全腦范圍的腦網絡組織方式改變，引起了與孤獨癥行為相關的表現(xiàn)。另外該研究結果與人群中如精神分裂，自閉癥以及注意力不集中引發(fā)的多動癥等神經發(fā)展性精神障礙中的核心變化高度相似。

引言

穩(wěn)定富足的環(huán)境往往更能培養(yǎng)出健康的心理，而暴露于不良的社會環(huán)境則容易誘發(fā)心理疾病。流行病學研究表明處于貧困、歧視對抗環(huán)境或者被社會隔離的人群有更大的風險引發(fā)心理疾病。而越來越多證據(jù)表明心理疾病往往是有先天的基因與后天生活的社會環(huán)境導致的。在早年生活中經歷母子分離與社會性隔離這樣的環(huán)境下將會消極的影響大腦的發(fā)育，這也是導致精神疾病的重要原因。

神經發(fā)展階段社會壓力的負面影響對精神分裂、孤獨癥譜系障礙（Austim Spectrum Disorder, ASD）以及注意缺陷與運動障礙(Attention Deficit Hyperactivity Disorder, ADHD)的形成起著重要的作用。伴隨著大腦前額相關信息作為診斷特征的改變，神經回路研究對上述疾病出現(xiàn)了廣泛的影響。大量的研究也表明前額腦區(qū)的功能連接減弱是精神分裂中的一大特征，而類似的情況在ADHD和ASD患者中也有發(fā)現(xiàn)。另外，前額葉功能連接降低導致認知控制機制的崩潰，使得這些疾病中常伴隨認知退行的癥狀。近來在這些精神障礙患者中越來越多大腦功能改變的發(fā)現(xiàn)被報道出來，使得人們的關注點由大腦局部異常轉向全局范圍內腦網絡組織結構的紊亂。例如，曾有研究使用基于圖論的分析方法，發(fā)現(xiàn)精神分裂患者相較于正常人存在腦網絡組織的失調，而因此導致局部以及全局范圍內網絡架構的異常。將類似的分析方法遷移到ASD以及ADHD等精神失調患者的研究中去，也發(fā)現(xiàn)了相似的腦網絡改變。

動物模型為人們對特定精神疾病的研究提供了可能，也為治療方法的研究提供幫助。關注于早期生活壓力風險因素的研究人員常以斷奶后隔離飼養(yǎng)的嚙齒類哺乳動物作為實驗對象，研究早年生活不幸對于精神疾病發(fā)展的影響，這種研究范式作為一種通用的研究方法被廣泛應用于大腦發(fā)育關鍵階段研究社會壓力對其影響。盡管一開始就把這一動物模型用于精神分裂癥患者的研究之中，但是人們往往只關心長期的行為活動、形態(tài)發(fā)育以及神經化學方面等相對具有代表性的特征。前脈沖抑制缺失作為一個感知運動損傷的指標在動物模型中也有發(fā)現(xiàn)，結合在空場測試中快速運動分析，可將測試得分作為孤立綜合征的判斷依據(jù)（Prepulse Inhibition、PPI，注釋：在強的震驚反射刺激出現(xiàn)之前20~500ms內對實驗動物施加一個本身不能引起震驚反射的聲音刺激，可以將震驚的幅度減小80%。這種在強烈的震驚反射刺激出現(xiàn)前的一段時間內出現(xiàn)的弱感覺刺激對震驚反射的抑制作用就叫做PPI，它是一種大腦適應復雜環(huán)境的感覺運動門控過程，注意等高級認知過程可以自上而下的調節(jié)PPI，PPI及其高級認知調節(jié)異常與多種精神疾病的病理心理機制有關。）。

綜上所述，考慮到社會生活壓力對于腦功能的影響，以及在大多數(shù)神經發(fā)育性疾病中廣泛存在的腦網絡改變，PWSI大鼠大腦連接性的詳細研究十分匱乏。本文致力于使用核磁影像學方法實現(xiàn)PWSI大鼠早期社會生活壓力相關性的描述性解釋，以及在神經發(fā)展障礙早期患者中觀察其主要的功能連接的變化。

基于精神疾病患者額區(qū)大腦連接性的改變，作者首先采用基于種子點到全腦的方法研究種子點到額區(qū)連接性的變化，由于在動物神經發(fā)育模型中還觀察到了枕區(qū)部分連接性的變化，所以將基于種子點的分析也擴展到枕區(qū)部分的分析。為了探究全腦范圍內更加廣泛的腦網絡組織方式的改變，本文使用了基于圖論的分析方法。使用一些局部指標來評估PWSI大鼠區(qū)域性結構調整和網絡樞紐的改變。隨后對腦網絡的模塊性、集成性、隔離性以及小世界屬性等方面進行了全局拓撲屬性的分析。該研究發(fā)表在Biological Psychiatry雜志（添加微信號siyingyxf或18983979082獲取原文及補充材料）。

方法與材料：

所有大鼠均在德國曼海姆中央心理健康研究所的動物設施中飼養(yǎng)。在出生后第28天給23只雄性Sprague Dawley大鼠斷奶，并隨機分配至群體飼養(yǎng)組（n = 12）或單獨的隔離飼養(yǎng)組（n = 11）。
行為學分析：

核磁影像學數(shù)據(jù)采集前為確定孤立綜合癥的產生，首先對實驗對象作空場環(huán)境下的過度運動測試以及聲音恐嚇刺激下的感知運動門控閾值下的前脈沖抑制響應（其實就是我們前文備注中的聽覺驚恐刺激）。檢測統(tǒng)計使用基于置換檢驗的非參數(shù)檢驗方法，進行一萬次隨機值置換以檢測組間差異的顯著性。

數(shù)據(jù)采集與預處理：

大鼠隔離飼養(yǎng)9周之后，使用布魯克9.4T小動物磁共振成像儀采集大鼠功能與結構數(shù)據(jù)，使用異氟烷進行麻醉，圖像采集期間僅使用美托嘧啶作鎮(zhèn)靜處理。

處理上相較于以往的影像學分析流程，這里特別加入逐幀錯位檢測(framewise displacement，就是前后圖像的相對位移距離)以及異常點檢測(scrubbing，即數(shù)據(jù)質量不符合的時間點圖像)功能，以保證最終的數(shù)據(jù)質量。
前額與枕葉部分基于種子點的分析：

使用基于種子點的分析方法來評估大腦局部連接的改變，基于前人的研究可以了解到這種區(qū)域特性的改變是精神分裂、ASD、ADHA以及受逆境影響的主要特征。因此，基于Schwarz提出的大鼠核磁腦圖譜選擇了4個雙側腦區(qū)作為種子點，計算種子點到前額部分的功能連接。這些種子點包括眶額葉皮層（orbitofrontal, OF）、前邊緣皮層（Prelimbic , PL）、邊緣下區(qū)（infralimbic , IL）以及額葉皮層（frontal association cortex, FrA）。此外，還將枕部腦區(qū)（視覺核心,visual cortex, V）也納入研究范圍進行了分析，以此來說明在孤獨癥患者以及神經發(fā)展階段的大鼠模型發(fā)生強烈的功能連接改變。

對于得到的相關分析的統(tǒng)計圖在SPM作團塊水平的多重比較矯正，體素級別顯著性設置為0.001，FWE矯正顯著性設置為0.05，以限制假陽性的結果。

Figure 1 voxel-wise FC的種子點

圖論分析：

網絡構建與連邊密度設置：

各個大鼠腦網絡的構建基于Schwarz提出的包含43個腦區(qū)的腦圖譜，以各個腦區(qū)的平均時間序列構建加權腦網絡。得到的皮爾遜相關矩陣按照其最大值作標準化，從而構建功能連接圖。腦網絡拓撲屬性的計算使用BCT（Brain Connectivity Toolbox）工具包計算。屬性的計算為了更加系統(tǒng)的反映差異而不受某一特定密度的影響，在只保留正連邊的前提下從33%到50%之間以1%為步長計算若干密度下的網絡屬性并計算曲線下面積。對于33%到50%這個密度取值范圍的確定基于以下的幾點小觀察：

1）在稀疏度低于33%時，有超過5%的節(jié)點在網絡中失去了與其他腦區(qū)的連接；

2）相較于較低的稀疏度在上述范圍內，其組間差異相對較為穩(wěn)定；

3）先前的研究也表明當網絡的稀疏度大于50%時，腦網絡結構就會開始變得隨機起來。更為重要的一點是上述33%到50%的網絡稀疏度會更加符合前人在研究人與動物腦網絡變化的設定。
局部指標分析：

為評估網絡結構的局部標記的變化，使用了連接強度（Strength）、介數(shù)中心度（Betweenness Centrality Index ,BCI）以及歸一化局部效率（Normalized Local Efficiency, NLE）這三個廣泛使用的局部指標進行評估。其中，連接強度來自于腦網絡中節(jié)點所有功能連邊的加權和；BCI（介數(shù)中心度）可反映某腦區(qū)作為重要節(jié)點連接各個獨立模塊的重要性，而局部效率（LE）則可以定量地反映節(jié)點與臨近節(jié)點作信息交換的效率。組間差異的統(tǒng)計通過打亂分組標簽的方式作置換檢驗（10000次置換，p<0.05）。多重比較矯正使用Bonferroni矯正，設置矯正的顯著性水平p<1/n=0.023。通過局部指標篩選數(shù)值較大的節(jié)點，將其看作網絡中較為重要的組成部分。按照以上的設定，本文定義若一個節(jié)點的兩個或更多的局部指標大于80%的節(jié)點，就將其視作一個重要的中心節(jié)點（在定義網絡中的重要節(jié)點上是存在多種方法的，具體研究中選用的方法往往是與具體問題相關的，比較普遍的方法是根據(jù)節(jié)點的度值、連接強度以及其他節(jié)點屬性的高低進行排序來定義的）。

在探索局部架構的變化之后，用斯皮爾曼相關分析的方法研究了與之密切關聯(lián)的行為結果，利用Bonferroni多重比較矯正方法降低結果中的假陽性。除此之外，還將分組作為一項干擾因子，利用偏相關分方法去除分組的影響比較其相關性。
全局屬性以及模塊性評估指標

全局腦網絡結構通?？梢悦枋鰹橐粋€集成性與分隔性相同統(tǒng)一的整體，集成性體現(xiàn)在大腦作為一個有機統(tǒng)一的構成，分隔性則體現(xiàn)在其可視為多個獨立功能模塊之間相互聯(lián)系構成的龐大系統(tǒng)。對于大腦整體性的分析，計算了全局效率（GE）、平均局部效率（mLE）、集聚系數(shù)（CC）、特征路徑長度（CPL）、小世界屬性以及抗特定攻擊的穩(wěn)定性（R(targ)）和抗隨機擾動的穩(wěn)定性（R(rand)）等多個指標來進行評估。集成性指標(GE，CPL)表征了大腦快速整合來自不同腦區(qū)信息的能力；分離性指標（mLE,CC）等則表明大腦在專一化數(shù)據(jù)處理的能力。小世界屬性則說明其平衡上述任務的能力。穩(wěn)定性則說明網絡抵抗擾動的能力。

還更近一步對前人在諸多神經發(fā)育性疾病中所觀察到的模塊性減弱現(xiàn)像進行測試。使用相當?shù)碾S機網絡圖保留節(jié)點數(shù)、度和權重分布作為參考進行歸一化，作為曲線下面積的計算和組間比較與局部指標相似。

結果：

自閉綜合征的行為測試：

在不同量級的聲音刺激下，PWSI（斷奶后社會性隔離）大鼠中前脈沖抑制大量降低，在80分貝時與對照的差異呈現(xiàn)顯著性（p<0.05），在84分貝后達到邊緣顯著（有產生差異的趨勢而不顯著，其實在當前的科研背景下，如果出現(xiàn)p值接近0.05但未小于，為了避免更多的爭議，做不顯著討論更合適）?？請鰷y試中孤立大鼠的運動能力呈現(xiàn)顯著的差異（P<0.05），而其他測試指標上并未出現(xiàn)顯著差異（P≥0.05）。這里的行為測試說明，相對于控制組的大鼠，PWSI的大鼠已經產生了類孤獨癥患者的明顯的疾病行為癥狀，在前述分析中我們說過，孤獨癥患者及精分、抑郁患者等都會產生前脈沖抑制顯著降低的情況。

Figure 2 A:不同聲強下PPI的差異;B:存在差異的運動指標

Figure 3無差異的若干行為指標

基于種子點的差異呈現(xiàn)出前額部分連接的減弱和枕部連接的增強：

按照假設在前額部位的連接呈現(xiàn)出低連通性，而實驗中也發(fā)現(xiàn)孤立大鼠相較于對照組前額兩個種子點的連接呈現(xiàn)出顯著降低的趨勢。具體來說，IL(邊緣下區(qū))相對與OF在左側半腦呈現(xiàn)出較低的功能連接，而OF(眶額葉皮層)與左側腦區(qū)在初級軀體感知皮層和右側尾殼核的連接較少。而在視覺核心則發(fā)現(xiàn)了反效果，在PWSI大鼠中，S1中雙側大腦功能連接顯著增加，小腦的部分區(qū)域功能連接顯著增加。

Figure 4 A:以IL(邊緣下區(qū))為種子點的前額區(qū)連接差異 ;

B:以OF(眶額葉皮層)為種子點的前額區(qū)域功能連接差異;

C:以視覺核心為種子點的后部功能連接差異

局部圖論指標揭示局部網絡結果的改變：

局部圖論指標的結果支持了上文中基于種子點的觀察，表現(xiàn)出前額區(qū)域整合較低，而后部腦區(qū)的整合較高。在圖5中，我們可以看到，屬于全腦網絡中核心節(jié)點的前額OF在介數(shù)中心度和局部效率上，PWSI大鼠都顯著小于對照組大鼠，而在與后部顳、枕連接緊密的屬于感覺運動網絡的中心節(jié)點M1(初級運動皮層)、S1(初級感知皮層)和V(初級視覺皮層)上，PWSI都呈現(xiàn)出了在不同局部屬性上的增強，圖6中的非核心節(jié)點的局部指標的分析也是相同的結果。這些都說明，前文中基于種子點的研究結果是可重復的，是一個魯棒的結果。

Figure 5 :各指標存在顯著差異的若干腦區(qū)

注釋：b中，紅色節(jié)點為屬于前額網絡的全腦核心節(jié)點，藍色為屬于感知運動網絡的全腦核心節(jié)點，黑色為全腦其他節(jié)點，核心節(jié)點的定義看前文。

中心節(jié)點的分析中，這些被認作中心節(jié)點的腦區(qū)大多位于前額處、感知運動系統(tǒng)的部分腦區(qū)或視覺處理系統(tǒng)之中。孤立大鼠的前額區(qū)中心節(jié)點呈現(xiàn)較低的BCI(介數(shù)中心度)和LE(局部效率）。相對的是位于感知運動和視覺處理系統(tǒng)的中心節(jié)點呈現(xiàn)處更高的強度、BCI和局部效率。

Figure 6非核心節(jié)點區(qū)域存在差異的各個腦區(qū)

總而言之，PWSI大鼠的網絡的局部屬性的改變指向其大腦區(qū)域結構性的改變。說明孤立大鼠出現(xiàn)前額的控制主導降低而伴隨非前額腦區(qū)的控制增強。

與局部指標改變腦區(qū)相關的行為改變的相關性分析：

孤立動物主要中心節(jié)點的改變與由中心腦區(qū)控制的相關空場行為測試和脈沖抑制退行存在相關。詳細來說，本文發(fā)現(xiàn)在OF腦區(qū)的BCI屬性與空場中的活動性是負相關的，說明前額腦區(qū)的節(jié)點屬性的下降導致了大鼠更差的活動性。而視覺區(qū)的局部效率與運動表現(xiàn)呈現(xiàn)正相關。此外還發(fā)現(xiàn)S1腦區(qū)的高強度與脈沖抑制退行存在聯(lián)系。這些分析表明：PWSI大鼠的孤獨癥行為與其特點腦區(qū)的網絡屬性的改變是存在顯著關系的。

Figure 7功能連接差異行為測試的相關性分析

全局屬性的分析：

全局屬性的比較增強了對大腦整體網絡結果的認識，揭示了大腦分非模塊化的特性。在嘗試尋找全局網絡的拓撲結果改變時，本文沒有在各個全局網絡屬性上發(fā)現(xiàn)顯著的組間差異。但是，在模塊化分析方面，發(fā)現(xiàn)PWSI大鼠中的模塊化顯著降低了。由于模塊的數(shù)量變化以及模塊體量的大小都會對模塊化屬性的計算產生影響，為探究兩個因素對于計算有何影響，本文使用置換檢驗的方法作一萬次置換，但是并未發(fā)現(xiàn)兩個參數(shù)對模塊化劃分的顯著影響。PWSI大鼠的模塊化程度的顯著的降低，或許可以說明PWSI大鼠比對照更加難以將大腦劃分出特定的網絡模塊。即PWSI大鼠在局部的拓撲結構的改變可能導致了其在特定網絡模塊結構方面的功能受損。

Figure 8兩組之間全局指標與模塊性分析的差異圖

Figure 9對照組與實驗組中心節(jié)點的對比

本文未找到兩組之間更具代表性的模塊劃分方法，作者使用多重群落檢測方法（在網絡分析當下最常用的模塊化檢測方法，或者也叫“社區(qū)發(fā)現(xiàn)”），由圖9可看到模塊化結構的差異，可以看出總體上兩組的劃分之間的良好一致性。

總結：

本文首次證明了社交孤立對大鼠大腦功能連接產生的深刻影響，結果表明早期社交壓力作為精神障礙發(fā)展風險因素跨學科診斷的神經機制。研究發(fā)現(xiàn)，隔離飼養(yǎng)的大鼠，與社會神經認知相關的額區(qū)的功能連接有所減弱，而后部枕區(qū)的連通性提高了。由網絡的角度出發(fā)，證明了網絡的中心向后轉移的變化，而與之相關的行為活動也發(fā)生相應的變化。并且，本研究也發(fā)現(xiàn)這種改變并不局限于某一特定腦區(qū)，而會在全腦范圍內產生影響，這表明早期的社交壓力會對大腦產生更加廣泛且復雜的影響。更為重要的是本文的結果與精神分裂，ASD以及ADHD等精神疾病的結果一致，說明了孤立大鼠與精神分裂的相似性。

總體而言，本文的驗證過程是嚴密的。首先，通過了在前脈沖抑制退行與空場中的過度反應的測試，證明動物模型行為判斷患病的有效性。這與前人研究中這兩項行為作為穩(wěn)健表征的一致性，并可用其對孤立綜合征進行評估。然后，對小樣本的研究進行了更為魯棒的非參數(shù)檢驗方法。最后，本文的發(fā)現(xiàn)可以總結為以下三點：

第一，發(fā)現(xiàn)PWSI大鼠基于兩個前額部位種子點的功能連接出現(xiàn)持續(xù)降低。額部連接性降低的結果顯示出與前人的在精神分裂癥的神經發(fā)育動物模型相一致，說明前額腦區(qū)的破壞可能是誘發(fā)該類疾病的核心機制。

第二，本實驗發(fā)現(xiàn)了PWSI大鼠腦網絡拓撲結果的異常改變，詳細來說即伴隨額區(qū)中心節(jié)點的減少，非額區(qū)中心節(jié)點逐漸增多。而后者這些節(jié)點往往位于后腦的感知運動系統(tǒng)。

第三，本結果為證明早期社會隔離而引發(fā)，以模塊化程度降低為主要特征的全腦網絡體系重建提供了證據(jù)。該結果與神經發(fā)育障礙患者群體的研究一致，社交隔離或許是導致這一變化的重要因素。社會壓力可能在脆弱的發(fā)育時期引起大腦網絡的異常連接性，特別是額葉大腦區(qū)域異常連接性的結果，為社會危險因素在神經精神疾病發(fā)展中的重要性提供了進一步的證據(jù)。
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